质粒纯化工艺两步法

 

随着基因治疗、细胞治疗和mRNA疫苗的发展，质粒DNA的应用场景从实验室快速进入到商业化药物生产。质粒可以单独作为疫苗或治疗药物，在病毒载体生产中可以作为病毒包装的原料，在mRNA疫苗的生产中也可作为体外转录的模板。

 

 

1、什么是质粒？

质粒是一类能在宿主细胞内独立于染色体外自主复制并稳定遗传的环状双链DNA分子，经过基因工程改造后可以接入外源DNA作为基因载体，转入宿主细胞。

2、质粒的生产、质量标准

质粒生产一般选择大肠杆菌作为宿主细胞，经发酵培养后裂解细胞得到质粒。初步纯化的质粒料液中一般含有3种构型的质粒（超螺旋、环状和线性DNA），以及HCP、HCD、RNA、内毒素等杂质。因此，为了得到高纯度的质粒DNA需进行纯化。

 

质粒质量标准如下：

 

3、质粒的纯化过程

质粒的纯化工艺通常采用三步法或两步法。三步法一般为凝胶过滤、亲和和离子交换，两步法一般为离子交换和疏水。

博进生物采用离子交换加疏水两步法，获得了符合标准的高纯度质粒。

 

 

 

第一步采用GP DEAE-60 去除RNA、HCP、内毒素等，捕获pDNA；

·BufferA：10mM EDTA+100mM Tris-HCI+O.4M NaCl  PH7.5

·BufferB：10mM EDTA+100mM Tris-HCI+1M NaCl  PH7.5

·EQ：Buffer A

·Elute：0-100% B   10CV

 

 

第二步使用GPB-60 去除ocDNA，收获scDNA。

·BufferA: 3M (NH₄)₂SO₄+10mM EDTA+100mM Tris-HCl  pH 7.5 

·BufferB: 10mM EDTA+100mM Tris-HCl  pH 7.5

·EQ: BufferA 

·Wash: 12%BufferB

·Elute: 50%BufferB