His标签蛋白纯化介质（NTA)

1. 产品简介

His 标签蛋白纯化介质适用于 His标签融合蛋白的纯化，采用该产品可快速从细胞发酵液中提取 His标签融合蛋白。

His 标签蛋白纯化介质（NTA）以琼脂糖凝胶微球为基质，采用耐受一定浓度 还原剂的次氮基三乙酸（NTA）为金属螯合配基，常规螯合 Ni²⁺（常称为镍填料），亦可根据客户需要螯合 Cu²⁺ ，Co²⁺ ，Zn²⁺等离子基团。

2. 产品特性

3. 应用

采用 His标签蛋白纯化介质对 His 融合蛋白进行分离纯化的过程通常包括平衡、上样、淋洗、洗脱等步骤。

平衡：用5~ 10CV 的平衡缓冲液平衡层析柱，至流出液电导和pH 不变（与平衡液 一致）。实际操作中，一般选用中性/弱碱性（pH 7~8）的高盐（0.15~ 1.0 M NaCl 或 其它中性盐）缓冲液。其中常用磷酸盐缓冲体系，如 20 mM PB+0.5 M NaCl, pH 7.4。对于结合力较强的带组氨酸标记的蛋白质 ，平衡缓冲液中可加入低浓度（20~40 mM）的咪唑。

上样：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。为了减少杂蛋白在层析柱上的吸附，可在确保目标蛋白吸附的情况下适当增加样品缓冲液中的咪唑。对于包涵体蛋白，相应地可在平衡、上样和洗脱的缓冲液中加入8M 尿素或者6M  盐酸胍。

淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱： 洗脱一般有两种方式，一是采用竞争试剂，如咪唑（0~0.5M）、组氨酸 （0~0.05M）、氯化铵（0~2M）等将蛋白质从柱子上置换下来；二是减小pH 值，洗脱目标蛋白，大多数蛋白质在pH 4~6 的范围内可被洗下来。用竞争试剂咪唑或减小 pH 值的方法洗脱蛋白质，金属离子仍结合在柱子上；若用竞争试剂组氨酸或者氯化铵洗脱蛋白质，会将金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来。

洗脱缓冲液中必须加入 0.15~ 1.0 M NaCl 以消除离子交换作用。梯度洗脱最好在起始平衡液的恒定 pH 下进行，可采用线性梯度或者阶越式梯度洗脱。

再生：介质使用多次后（具体与发酵液样品及杂质特性等有关），或者螯合其它金属离子前，需要进行再生处理。

1） 脱 Ni：

用 5 倍体积的 EDTA 溶液（0.2M EDTA+0.5M NaCl, pH 7.0）以低流速（建议 正常上样流速的 1/2）清洗介质，然后用 5 倍体积的 0.5M NaCl 清洗以去除残留的EDTA。

2） 清洗：

可用 2~3 倍体积以上的 2M NaCl 清洗，除去以离子键结合的蛋白，再用 3 倍体积以上的纯水冲洗。

可用5 倍体积的0.5- 1M NaOH（或 2M NaCl 溶液）清洗介质，除去色素或者其他强吸附蛋白，然后用 0.2M PBS 缓冲液平衡冲洗 5-10 倍体积（有条件的情况下可通过pH 检测溶液pH 值变化，pH 洗至缓冲液的pH 值即可）。

可用 5~ 10 倍体积的 70%乙醇或 30% 异丙醇清洗（20 min 以上），并用 3~ 10倍体积的纯水冲洗。请注意，异丙醇不易清洗干净，建议加大冲洗体积。